Amplite 基質金屬蛋白酶MMP活性檢測試劑盒 紅色熒光 是美國AAT Bioquest生產的用于檢測MMP的試劑盒，基質金屬蛋白酶（MMP）構成鋅依賴性內肽酶家族，其在細胞外基質內起作用。 這些酶負責結締組織的分解，并且在骨重塑，月經周期和組織損傷的修復中是重要的。雖然很難評估MMP對某些病理過程的確切貢獻，但MMP似乎在關節炎的發展以及癌癥的侵襲和轉移中起關鍵作用。
我們的Amplite 通用熒光MMP活性測定試劑盒使用Tide Fluor 2（TF2）/ Tide Quencher 2（TQ2）熒光共振能量轉移（FRET）肽作為通用MMP活性指示劑。 它旨在檢查MMP酶的一般活性并篩選MMP抑制劑。 在完整的FRET肽中，TF2的熒光被TQ2猝滅。 在通過MMP切割成兩個單獨的片段后，回收TF2的熒光。 TF2探針具有優異的熒光量子產率和更長的波長，比EDANS / Dabcyl FRET底物靈敏得多。 其信號可通過熒光酶標儀在Ex / Em = 490/525 nm處輕松讀取。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供的Amplite 基質金屬蛋白酶MMP活性檢測試劑盒。
96孔板測定示例
概述
添加適當的對照或測試樣品（50μL）
預孵育10-15分鐘
添加MMP Green 底物溶液（50μL）
孵育0分鐘（用于動力學讀數）或30分鐘至1小時（終點讀數）
在Ex / Em = 490/525 nm處監測熒光強度
注意：在開始實驗之前，在室溫下解凍所有試劑盒組分。
操作方法
1.根據需要制備含有生物樣品的MMP。
2.pro-MMPs：
2.1制備2mM APMA工作溶液（2X）：用1：500稀釋1M APMA（組分B）和測定緩沖液（組分C），得到2mM APMA工作溶液（2X）。
注意：APMA屬于有機汞。 小心輕放！ 根據當地法規處理。
2.2用APMA包埋MMPs：用等體積的2mM APMA工作溶液（2X，來自步驟2.1）孵育含有MMP的樣品或純化的MMPs。 有關孵育時間，請參閱說明書中的附錄I. 在實驗之前立即MMP。
注意1：將含酶樣品保存在冰上。 避免劇烈渦旋酶。長時間儲存活化酶會使酶失活。
注意2：對于酶活化，優選在較高蛋白質濃度下活化。后，您可以進一步稀釋酶。
3.準備工作解決方案：
3.1制備MMP Green 底物工作溶液：用1：100稀釋MMP Green 底物（組分A）和測定緩沖液（組分C），如說明書中表1所示。
3.2制備MMP稀釋：如果使用純化的MMP，則在測定緩沖液（組分C）中將MMP稀釋至合適的濃度。
注意：Pro-MMP需要在使用前（參見步驟2.2）。 避免劇烈渦旋酶。
3.3制備抑制劑和化合物稀釋：如果您正在篩選MMPs抑制劑，請根據需要稀釋已知的MMPs抑制劑和測試化合物。
4.根據說明書中的表2和表3在96孔微孔板中建立酶促反應：
5.運行酶反應：
5.1如果您正在篩選MMPs抑制劑，則將培養板在酶反應（例如25°C或37°C）的所需溫度下預孵育10-15分鐘。
5.2將50μL（96孔）或20μL（384孔）MMP Green 底物溶液（來自步驟3.1）加入到測定板的樣品和對照孔中。充分混合試劑。
5.3用Ex / Em = 490 / 525nm的熒光板讀數器監測熒光強度。
動態讀數：立即開始測量熒光強度，每5分鐘連續記錄數據30至60分鐘。
終點讀數：在室溫下孵育反應30至60分鐘，如果可能，避免光照。 充分混合試劑，然后測量熒光強度。
