ReadiLink Rapid mFluor 780 抗體提供了一種以微觀方式標(biāo)記抗體的方法。該試劑盒僅需要兩個(gè)簡(jiǎn)單的混合步驟而無(wú)需純化步驟。 試劑盒中使用的iFluor 和mFluor 染料的琥珀酰亞胺酯（SE）顯示出與蛋白質(zhì)的脂族胺的良好反應(yīng)性和選擇性，并形成羧酰胺鍵，其與天然肽鍵相同且穩(wěn)定。 iFluor 和mFluor-抗體綴合物可用于免疫熒光染色，熒光原位雜交，流式細(xì)胞術(shù)和其他生物學(xué)應(yīng)用。 每個(gè)ReadiLink 抗體標(biāo)記試劑盒都提供了進(jìn)行兩次偶聯(lián)反應(yīng)（2x50μg蛋白質(zhì)）的所有必需成分。 每個(gè)試劑盒可用于標(biāo)記50-100μg單克隆，多克隆抗體或其他蛋白質(zhì)（> 10 kDa），只需兩個(gè)簡(jiǎn)單的混合步驟。抗體標(biāo)記試劑盒ReadiLink Rapid mFluor 780 抗體是美國(guó)AAT Bioquest研發(fā)的產(chǎn)品。
標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（標(biāo)記50μg蛋白質(zhì)）
將所有組分加熱并在打開前將樣品瓶短暫離心，并在開始結(jié)合前準(zhǔn)備所需的溶液。 以下SOP是標(biāo)記抗HDAC IgG抗體的實(shí)例。
1.準(zhǔn)備蛋白質(zhì)溶液（溶液A）：
為了標(biāo)記50g蛋白質(zhì)（假設(shè)目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度為1mg / mL），將5L（總反應(yīng)體積的10％）的反應(yīng)緩沖液（組分B）與50L目標(biāo)蛋白質(zhì)溶液混合。
注1.如果您的蛋白質(zhì)濃度不同，請(qǐng)相應(yīng)調(diào)整蛋白質(zhì)體積，使~50μg蛋白質(zhì)可用于標(biāo)記反應(yīng)。
注2：為了標(biāo)記100g蛋白質(zhì)（假設(shè)目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度為1mg / mL），將10μL（總反應(yīng)體積的10％）反應(yīng)緩沖液（組分B）與100μL目標(biāo)蛋白質(zhì)溶液混合。
注3：蛋白質(zhì)應(yīng)溶解于pH7.2-7.4的1X磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中;如果蛋白質(zhì)溶解在甘an酸緩沖液中，必須用1X PBS（pH 7.2-7.4）透析，或使用Amicon Ultra-0.5超濾管，Ultracel-10超濾膜，10 kDa（來(lái)自Millipore的cat＃UFC501008）去除用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（如硫酸銨和乙酸銨）。
注4：不純的抗體、穩(wěn)定的牛血清蛋白（BSA）抗體或明膠不會(huì)被很好的標(biāo)記。
注5：如果蛋白質(zhì)濃度小于1 mg / mL，則結(jié)合效率會(huì)降低。為獲得標(biāo)記效率，建議蛋白質(zhì)濃度范圍為1-2 mg / mL。
2.運(yùn)行結(jié)合反應(yīng)：
2.1將蛋白質(zhì)溶液（溶液A）加入到一瓶標(biāo)記染料（組分A）中，通過(guò)反復(fù)移液幾次將其混合均勻，或?qū)⑿∑繙u旋幾秒鐘。
注意：如果要標(biāo)記100 µg蛋白質(zhì)，請(qǐng)使用兩個(gè)小瓶（組分A），將100 µg蛋白質(zhì)分成2 x 50 µg蛋白質(zhì)，并使每個(gè)50 µg蛋白質(zhì)與一小瓶標(biāo)記染料反應(yīng)，然后合并兩個(gè)小瓶，用于下一步。
2.2將綴合反應(yīng)混合物在室溫下保持30-60分鐘。
注意：如果需要，可以旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)綴合反應(yīng)混合物更長(zhǎng)的時(shí)間。
3.停止共軛反應(yīng)：
3.1加入5 µL TQ染色淬滅緩沖液（組分C）（對(duì)于50 µg蛋白質(zhì)）或加入10 µL TQ染色淬滅緩沖液（組分C）（對(duì)于100 µg蛋白質(zhì)）。加入的緩沖液是總反應(yīng)體積的10％。
3.2在室溫下孵育10分鐘。
3.3標(biāo)記的蛋白質(zhì)（抗體）完成。
