潔凈車間用食品廠臭氧機滅菌后沉降菌檢測方法

      潔凈車間滅菌方法有多種：紫外線滅菌、化學熏蒸、臭氧滅菌等；這里簡單介紹臭氧滅菌后對潔凈車間沉降菌的檢測":

A:操作方法：對潔凈車間用食品廠臭氧機{車間臭氧機}滅菌1小時后進行沉降菌檢測

 B:名稱：潔凈區微生物檢測操作規程

C:關鍵詞：潔凈區、食品廠臭氧機、車間臭氧機、微生物檢測

D:目的：尋得優質食品廠臭氧機、車間臭氧機廠家并規范潔凈區微生物檢測

E:原理：臭氧滅菌技術

F:適用范圍：100級、1萬、10萬、30萬級潔凈區環境。

1.        沉降菌檢測

1）       在萬級潔凈區內的關鍵操作點和潔凈室內每周檢測一次沉降菌和浮游菌；在10萬級潔凈區內其檢測頻次為每月檢測一次。30萬級每季度檢測一次沉降菌。

2）       由微生物檢測員按《養基的配制操作規程的要求配制肉湯瓊脂培養基，培養皿使用Φ90mm×15mm，于121℃濕熱滅菌20分鐘，取出備用。

3）       做好潔凈區消毒工作，開啟潔凈區凈化空調系統，正常運行不少于30分鐘；對單向流如100級的凈化工作臺和層流罩要在凈化系統運行10min后開始。

4）       靜態測試在除測試人員外，室內無生產人員的情況下進行，動態測試在已處于正常生產狀態下進行。

5）       采樣點布置選用對角線法，要求布置地面四個方向，工作線上左右，關鍵設備頂上放置一個。

6）       萬級、10萬級、30萬級的zui少采樣點數可按下表確定。

在滿足zui少測點數的同時，還宜滿足zui少培養皿數，見下表

7）       百級區只有凈化工作臺下的局部范圍，其面積小于10m2，因此百級區取樣點至少為3個。

8）       測試人員按潔凈室級別規定的程序更換潔凈服進入潔凈區；靜態測試時，室內人員不得多于2人。

9）       將制備好的肉湯瓊脂培養基按采樣點布點位置離地0.8～1.5m處放置，打開培養皿蓋，暴露30分鐘，檢測人員及時填寫記錄，記錄房間溫濕度，壓差及測試狀態。

10）    蓋好皿蓋，將培養皿倒置于恒溫培養箱內，在30～35℃中培養48小時，并用3只培養皿作對照。

11）    用透射光于培養皿背面或正面仔細觀察平皿上所有菌落數，要注意菌落與培養基沉淀物的區別，然后用5～10倍放大鏡檢查有否遺漏。

12）    計算平均菌落數=（M1＋M2……＋Mn）／n，式中M1：1號培養皿菌落數，M2：2號培養皿菌落數，n：培養皿數。

13）    用平均菌落數判斷潔凈室空氣中的微生物，潔凈區的平均菌落數（靜態測試）：100級≤1個/皿，萬級≤3個／皿，10萬級≤10個／皿，30萬級≤15個／皿。

14）    如超過標準，則必須對此區域重新消毒，重新采樣兩次，測試結果均須合格；否則要向質量管理部通報，并采取相應的措施。

15）    檢測人員必須向QA部門發“潔凈級別檢測記錄”，取樣和微生物培養及檢測人員均要在記錄上簽名，QA部門主管審核，記錄由質量管理部保存三年。

2.        浮游菌檢測

1）       對萬級和10萬級潔凈區要進行浮游菌的檢測，在萬級區內的關鍵操作點和潔凈室內每周檢測一次，10萬級潔凈區內其檢測頻次為每月檢測一次。

2）       浮游菌取樣使用浮游菌采樣器，采樣器必須要有流量計和定時量，并按儀器的檢定周期，定期對儀器作檢定，以保證測試數據的可靠性。

3）       采樣器進入被測房間前要先用消毒劑滅菌，用于100級潔凈室的采樣器是一直放在房間內；采樣時使用規定為Φ150mm×15mm培養皿。

4）       由微生物檢測人員按《培養基的配制操作規程》的要求配制營養瓊脂培養基，于121℃濕熱滅菌20分鐘，取出備用。

5）       浮游菌取樣與沉降菌一樣可分為靜態測試和動態測試兩種狀態；各種潔凈度的采樣點數目和zui小采樣量如下表所示。

浮游菌取樣點數目及zui小采樣量

滅菌原理

臭氧是一種強氧化劑，滅菌過程屬生物化學氧化反應。臭氧滅菌有以下3種形式：

1.臭氧能氧化分解細菌內部葡萄糖所需的酶，使細菌滅活死亡。

2.直接與細菌、病毒作用，破壞它們的細胞器和DNA、RNA，使細菌的新陳代謝受到破壞，導致細菌死亡。

3.透過細胞膜組織，侵入細胞內，作用于外膜的脂蛋白和內部的脂多糖，使細菌發生通透性畸變而溶解死亡。

臭氧殺菌

滅活機理

臭氧對細菌的滅活反應總是進行的很迅速。與其它殺菌劑不同的是：臭氧能與細菌細胞壁脂類雙鍵反應,穿入菌體內部，作用于蛋白和脂多糖，改變細胞的通透性，從而導致細菌死亡。臭氧還作用于細胞內的核物質，如核酸中的嘌呤和嘧啶破壞DNA。

滅活機理

臭氧對病毒的作用首先是病毒的衣體殼蛋白的四條多肽鏈，并使RNA受到損傷，特別是形成它的蛋白質。噬菌體被臭氧氧化后，電鏡觀察可見其表皮被破碎成許多碎片，從中釋放出許多核糖核酸，干擾其吸附到寄存體上。

臭氧殺菌的*性是不容懷疑的。

臭氧殺菌原理

臭氧滅菌或抑菌作用，通常是物理的、化學的及生物學等方面的綜合結果。其作用機制可歸納為：（1）作用于細胞膜，導致細胞膜的通透性增加，細胞內物質外流，使細胞失去活動；（2）使細胞活動必需的酶失去活性；（3）破壞細胞內的遺傳物質或使其失去功能。臭氧殺滅病毒是通過直接破壞核糖核酸或脫氧核酸完成的。而殺滅細菌、霉菌類微生物則是臭氧首先作用與細胞膜，使細胞膜的構成收到損傷，導致新陳代謝障礙并抑制其生長，臭氧繼續滲透破壞膜內組織，直到死亡。

臭氧滅菌

人類自發現并使用臭氧以來，一直對臭氧的滅菌性能進行試驗[1]，這方面的試驗報告很多，以下從幾個方面進行綜述。

臭氧－細菌繁殖體

李懷恩等觀察了臭氧氣體對空氣中綠膿桿菌的殺滅作用。在15℃，濕度73%，臭氧濃度0.08-0.6ppm時，30分鐘內殺滅率達到99.9%以上；伍學洲等試驗臭氧對大腸桿菌殺滅率為*，對*殺滅率為95.9%，對綠膿桿菌殺滅率為89.8%，顧士圻等試驗，臭氧對大腸桿菌和*殺滅率分別為99.7%、99.9%。居喜娟等試驗用臭氧可殺滅空氣中的白色葡萄球菌99.99%；Burleson等試驗將臭氧氣體通入染有*、大腸桿菌、熒光假單胞菌、鼠傷*、福氏痢疾桿菌、霍亂弧菌的磷酸鹽緩沖液中，作用15秒后，以上細菌全部殺滅；白希堯等發現臭氧水溶液殺菌作用強大，且速度極快，濃度為0.3mg/L的臭氧水溶液作用1分鐘，大腸桿菌和*的殺滅率均達*。

細菌芽胞

瞿發林等報告，以5.5mg/m?的臭氧作用下45分鐘，可將100mL塑料瓶內滴染的枯草桿菌黑色變種芽胞*殺滅；居喜娟等報道，在1m?試驗柜內，開啟500mg/h的臭氧發生器60分鐘可對空氣中的枯草桿菌黑色變種芽胞殺滅率達99.95%；歐陽川等在動態試驗條件下，將臭氧氣體通入染菌井水中，臭氧濃度達3.8-4.6mg/L時，作用3-10分鐘，水中枯草桿菌黑色變種芽孢殺滅率達99.999%。

病毒

李紹忱等試驗發現，經10.3mg/m3濃度臭氧作用30分鐘后，乙型肝炎表面抗原（HbsAg）的滴度從1:256降至1:64。史江等報告，臭氧濃度13.6mg/m3時使用30分鐘，使HbsAg破壞99.99%，使用甲型肝炎病毒抗原（HAAg）破壞*；Wolo等實驗證明0.5ppm的臭氧可滅活空氣中的甲型流感病毒99%；Herbold等報告，在20℃水中，臭氧濃度為0.13mg/L時，可以*的滅活脊髓灰質炎病毒I型（PVI）。臭氧滅活病毒速度極快，當臭氧濃度分別為0.09mg/L-0.8mg/L時，在反應zui初5秒鐘內，噬菌體T2即可被滅活5-7個對數值。Finch發現水中含臭氧濃度40μg/L時，作用20秒鐘，可使大腸桿菌噬菌體ms2滅活4個對數值。Vaughn等在4℃條件下，對比了臭氧對猿輪狀病毒SA-H和人輪狀病毒2型的滅活效果,發現兩種病毒均能被0.25mg/L的臭氧迅速滅活。Crpend等檢測了經臭氧處理后的血清中愛滋病毒（HIV）的滅活情況，證明當臭氧濃度為4mg/L時，可將滴度為106CID50/mL HIV全部滅活，病毒滴度下降6個對數值。

真菌

汪華明等報道,臭氧濃度為9.6mg/L時，作用100分鐘對雜色曲霉與桃色擬毒霉的殺滅率達*，對蠟葉枝孢霉23mg/L30分鐘、青黑霉在12.5mg/L作用35分鐘、桔青霉在15.4mg/L作用30分鐘，尖鐮孢霉在15.5mg/L時作用20分鐘，均可達*滅活率。對于煙曲霉、細交鏈孢霉、爪哇毛霉等，在臭氧濃度為3.85-10.7mg/L時作用10-20分鐘滅活率達96.4%。伍學洲等發現，臭氧在30分鐘內對青霉菌的殺滅率為93.8%，對毛霉菌的殺滅率為*；白希堯等報告，濃度為15mg/L的臭氧水溶液作用1分鐘，可*地殺滅試驗中的黑曲霉和酵母。

原蟲

Finch等比較了22℃時臭氧對蘭氏賈弟鞭毛蟲和鼠型賈弟鞭毛蟲色曩的滅活效果，當Ct值0.86mg•min/L時，可使鼠型賈弟鞭毛蟲減少4個對數值，Ct值為2.5mg•min/L時，使蘭氏賈弟鞭毛蟲減少4個對數值。Korich等比較了臭氧、二氧化氯、氯對凈化水中的微小隱孢子蟲卵囊的滅活作用試驗證明，1ppm的臭氧作用5分鐘可以滅活90%的卵囊，1.3ppm的二氧化氯則需作用1小時，80ppm的氯則需作用1.5小時才能達到同樣效果。

臭氧殺菌消毒

臭氧殺菌機理以氧化作用破壞微生物膜的結構實現殺菌作用。臭氧對細菌的滅活反應總是進行的很迅速，與其它殺菌劑不同的是：臭氧能與細菌細胞壁脂類雙鍵反應,穿入菌體內部，作用于蛋白和脂多糖，改變細胞的通透性，從而導致細菌死亡。臭氧還作用于細胞內的核物質，如核酸中的嘌呤和嘧啶破壞DNA。臭氧首先作用于細胞膜，使膜構成成份受損傷而導致新陳代謝障礙，臭氧繼續滲透穿透膜而破壞膜內脂蛋白和脂多糖，改變細胞的通透性，導致細胞溶解、死亡。臭氧滅活病毒則認為氧化作用直接破壞其核糖核酸RNA或脫氧核糖核酸DNA物質而完成的。臭氧對病毒的作用首先是病毒的衣體殼蛋白的四條多肽鏈，并使RNA受到損傷，特別是形成它的蛋白質。噬菌體被臭氧氧化后，電鏡觀察可見其表皮被破碎成許多碎片，從中釋放出許多核糖核酸，干擾其吸附到寄存體上。