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目的應(yīng)用物體識別方法研究D2半乳糖長期注射致腦老化小鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力,并比較物體識別方法與Morris 水迷宮方法對該模型測試的靈敏性。方法C57BL/ 6 小鼠,隨機(jī)分成正常對照組、D2半乳糖低劑量組(50mg/ kg ,sc) 、D2半乳糖高劑量組(100mg/ kg ,sc) ,連續(xù)造模8 周。以物體識別方法和Morris 水迷宮方法測試各組動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。結(jié)果在物體識別測試中, D2半乳糖高劑量組分辨指數(shù)(15. 71 ±3. 94) 較對照組(45. 89 ±7. 41) 減低具有非常顯著性意義( P < 0. 001) ,低劑量分辨指數(shù)(24. 69 ±6. 25) 與對照組的差異也存在顯著性意義( P < 0. 05) 。在Morris 水迷宮測試中,D2半乳糖高劑量組動(dòng)物逃逸潛伏期比對照組延長有顯著性意義( P < 0. 01) ;高劑量組在目標(biāo)象限空間探索所停留時(shí)間與游泳距離比均較正常對照組減少有顯著性意義( P < 0. 05) 。結(jié)論D2半乳糖可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)顯著的物體識別能力障礙,用物體識別測試方法比Morris 水迷宮方法更靈敏地反映該模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。

【關(guān)鍵詞】D2半乳糖; 學(xué)習(xí)記憶; 物體識別; 水迷宮; 腦老化

一、實(shí)驗(yàn)概述

物體識別測試(Object Recognition Test) 是利用動(dòng)物先天對新物體有探索傾向的原理而建立的學(xué)習(xí)記憶測試方法。該方法具有讓鼠在自由活動(dòng)狀態(tài)下進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶測試的特點(diǎn),能更近似地模擬人類的學(xué)習(xí)記憶行為。本研究擬應(yīng)用物體識別方法研究D2半乳糖長期注射致腦老化小鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力,并與水迷宮行為學(xué)測試相比較,為促進(jìn)物體識別測試方法在我

國學(xué)術(shù)界的應(yīng)用提供借鑒材料。

因C57BL/ 6 近交系小鼠已被證明有良好物體識別與空間記憶能力, 以及隨衰老而記憶力減退規(guī)律,本實(shí)驗(yàn)選用C57BL/ 6 小鼠,3 月齡,雌性,體質(zhì)量(20 ±2) g ,購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心(許可證號:SCXK(京) 200220001) ,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,隨機(jī)分成正常對照組、D2半乳糖低劑量組、D2半乳糖高劑量組。小鼠均在無特殊致病原(SPF) 級動(dòng)物室飼養(yǎng)至行為學(xué)測試前。低劑量組每日于背部皮下注射D2半乳糖(購自Sigma 公司, G5388) 50mg/ kg ,高劑量組每日皮下注射D2半乳糖100mg/ kg ,對照組注射等量生理鹽水,連續(xù)8 周。

二、行為學(xué)測試

1. 物體識別試驗(yàn): 造模8 周后, 參考Ennaceur等方法進(jìn)行物體識別試驗(yàn),裝置主要由一個(gè)測試盒(自制) 與2 套(每套2 只) 測試物體組成,測試物體在實(shí)驗(yàn)前經(jīng)篩選有近似的小鼠喜好程度。本實(shí)驗(yàn)測試盒以45cm ×35cm ×20 cm 的乳白色硬塑料方盒自制而成。（備注：物體識別實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)可以選購上海欣軟公司研發(fā)的SuperMaze軟件，型號為XR-XX117），物體A 套為藍(lán)色方形硬塑兒童玩具,約4. 5cm ×4. 5cm ×5 cm ,B 為白色圓柱形塑料盒,底面直徑4cm ,高7cm ,兩物體均足夠重以防止小鼠推動(dòng)。測試環(huán)境要求在隔音、避光的場所。在測試盒上方以60W 白光燈照射使盒內(nèi)無陰影處。

測試主要分適應(yīng)期、熟悉期和識別期：

第1 天為適應(yīng)期:在上述條件下,將鼠放入測試盒的中間,盒內(nèi)未放任何物體,讓其自行適應(yīng)性活動(dòng)10min。

第2 天為熟悉期: 在測試盒中放入2 個(gè)相同的玩具(AA 或BB) ,距離長軸(45cm) 兩側(cè)壁8cm ,將鼠從盒中距物體等距離處放入。測試者兩手各握1 只秒表(上海秒表廠) ,每只秒表對著1 個(gè)動(dòng)物,開始紀(jì)錄其在每個(gè)物體上的探索時(shí)間(以鼠嘴湊近物體約2cm 范圍內(nèi)計(jì)時(shí),鼠爬在玩具上玩或者只是在物體附近走則能計(jì)入) ,以秒表間斷累積計(jì)時(shí)測定鼠探索每個(gè)物體的時(shí)間總和,為在第3 天的計(jì)時(shí)提供練習(xí)。

第3 天為識別測試期:將另外一套中的一個(gè)物體替換前一天中的一個(gè)玩具放入盒內(nèi)(AB 或BA) ,將鼠放在盒中距兩物體等距離處10min。每只鼠測試完成后,用酒精擦拭物體以消除鼠停留在物體上的氣味,并且按次序輪流調(diào)換各物體在盒內(nèi)的位置,以消除鼠對物體在盒內(nèi)位置喜好程度不同而帶來的影響。為進(jìn)一步減少兩種物體本身差異對鼠探索時(shí)間比較的影響,本實(shí)驗(yàn)以兩位測試者在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用兩個(gè)相同裝置測試每組的一半動(dòng)物,但兩裝置中的物體

相對應(yīng)鼠的新舊次序相反(如A 在一測試者為新物體在另一測試者則為舊物體) 。鼠的物體識別能力以第3 天探索新舊物體的時(shí)間,并以探索時(shí)間計(jì)算分辨指數(shù)(discrimination index ,DI) 來評價(jià)。分辨指數(shù)計(jì)算公式為:DI = (N-F) / (N + F) ×100 % ,式中N 為在探索新物體所用的時(shí)間,F 為探索舊物體所用的時(shí)間。

2. Morris 水迷宮:由4d 的訓(xùn)練期和第5天的空間探索試驗(yàn)組成,見參考文獻(xiàn)。