據標記物的不同，免疫細胞化學技術可分為免疫熒光細胞化學技術，免疫酶細胞化學技術，免疫鐵蛋白技術，免疫金-銀細胞化學技術，親和免疫細胞化學技術，免疫電子顯微鏡技術等。近些年來，核酸分子原位雜交技術采用*、等非放射性物質標記探針，和免疫細胞化學技術密切結合，發展為雜交免疫細胞化學技術。不同的免疫細胞化學技術，各具有*的試劑和方法，但其基本技術方法是相似的，都包括抗休的制備，組織材料的處理、免疫染色、對照試驗、顯微鏡觀察等步驟。還有雙重和多重標記技術也有重要的用途。

一、抗體的制備和配制

(一)抗體的制備

這是免疫細胞化學技術的首要試劑，必需制備具有很高特異性和敏感性的價抗體，這將在本書第二章 中詳述。目前國內外市場各種特異性抗體日益增多，許多實驗室直接應用市售產品，現在我國自制抗體種類少，發展抗體生產十分必要。尤其要定位一種新的抗原物質，能夠自制較好。

(二)抗體的配制

包括抗體貯存液和抗體使用液的配制方法。新制備或購進的是原液或凍干品，抗血清為全血清，單克隆抗體是培養上清液或腹水。

1.抗體貯存 獲得新抗體后，應先根據生產廠家提供的抗體效價，將其分裝，可每10μl或100μl/支分裝入安瓿或0.25ml帶蓋塑料管中，密封。放入-20。C~40。C冰箱中保存備用，一般可保存1~2年。小量分裝的抗體可1次用完，避免反復凍融而影響效價的降低。一般用前新鮮配制使用液體，稀釋的抗體不能長時間保存，在4。C可存入1~3天，超過7天效價顯著降低。

2.抗體使用液的配制 這是任何免疫細胞化學方法中zui重要的一環，無論是一抗、二抗和各種標記抗體，用前都必須按不同免疫染色方法和抗原性強弱與抗原的多少，稀釋使用的各種抗體原液，以便獲得*免疫染色結果。

(1)抗體*稀釋度的測定方法：用已知陽性抗原切片，進行免疫染色，將其陽性強度與背景染色強度以“+”表示，可分為++++、+++、++、+、(-)。++++為zui強陽性，+++為強陽性，++為較強陽性，+為弱陽性，(-)為陰性。

①直接測定法：用于測定*抗體的*稀釋度，其它條件穩定可靠。將一抗稀釋為1：50、1：100、1：2001：400、1：500等5個稀釋度滴加在陽性抗原切片上，同時設一替代和陰性對照，結果如表1-1：

表 1-1 選擇*稀釋抗血清方法

一抗稀釋度     特異性染色強度     非特異性背景染色度
1：50     ++++     ++
1：100     ++++     ++
1：200     ++++     ++
1：400     +++     +
1：500     ++     （-）
陰性對照     （-）     （-）
從表中結果可見，*抗體稀釋到1：400時陽性結果呈強陽性，背景染色減少，其*稀釋度在1：400~500之間。再作1：420、1：440、1：460、1：480、1：500稀釋后染色，找出*稀釋度。

②棋盤(方陣)測定方法：當測定兩種以上抗體的*配合稀釋度時，必須采用此法(見表1-2)。

表1-2 兩種以上抗體*配合稀釋度選擇表

第二抗體     第 一 抗 體
1：500     1：1000     1:2000     1：4000
1：100     ++++（++）     ++++（+）     +++（±）     +（-）
1：200     ++++（+）     +++（-）     ++（-）     ++（-）
1：400     ++（-）     +（-）     -     -
括號內為背景染色結果

從表中可見*抗體1：1000，第二抗體1：2000接近*稀釋度，再將一 抗體作1：600、1：700、1：800、1：900和1：1000稀釋，即可找出*稀釋度。

(2)抗體稀釋液的配制：常用0.01mol/l pH7.4PBS或TBS緩沖液作抗體稀釋液。可用以下方法配制的抗體稀釋液，防止抗體效價下降，減少抗體在組織上的非特異性吸附：取0.05mol/l pH7.4 TBS100ml，加溫到60。C，再加入明膠100mg，攪拌溶解后，冷卻至室溫，加入1g牛血清白蛋白，加入NaN3200mg溶解后，過濾，分裝，4。C保存。

抗體的*稀釋度由于各種抗體的效價不同，組織中抗原強弱不一，應根據不同情況作適當的調整，以取得中等陽性稀釋度為佳，因其既適合于抗原性強和含量多的標本，也可用于抗原性弱的標本。

二、組織材料的處理

組織材料的處理是獲得良好免疫組織化學結果的前提，必需保證要檢測的細胞或組織取材新鮮，固定及時，形態保存完好，抗原物質的抗原性不丟失、不擴散和被破壞(下節 詳述)。

三、免疫染色

可在細胞涂片或組織切片上進行免疫染色。一般程序是：①標記抗體與標本中抗原反應結合;②用PBS洗去未結合的成分;③直接觀察結果(免疫熒光直接法);或顯色后再用顯微鏡觀察(免疫酶直接法)。在此基礎上發展出間接法，多層法，雙標記法等各種方法，將在本書各有關章 節 內詳述。

在免疫染色中應特別注意增強特異性染色，減少或消除非特異性染色。在各種免疫染色中都必須注意以下幾個問題：

1.增強特異性染色的方法

(1)蛋白酶消化法：其作用是暴露抗原，增加細胞和組織的通透性，以便抗體與抗原zui大限度的結合，增強特異性染色和避免非特異性染色。這種方法已廣泛用于各種免疫細胞化學染色，常用的蛋白酶有*、*以及*(pronase)等;也可用3mol/L尿素處理切片，達到酶消化的目的。各種酶的配制和使用方法詳見附錄。酶消化的時間和溫度因各種抗原對消化的敏感性不同，應根據酶的活性通過預試驗確定，消化的時間還與組織固定的時間有關，一般是陳舊固定組織所需時間長，以37。C為宜。消化時間短的組織可在室溫中進行。消化處理時間過長能損傷組織，易使切片脫落，應使用切片粘附劑，消化時間盡量縮短。

(2)合適的抗體稀釋度：抗體的濃度是免疫染色的關鍵，如果抗體濃度過高，抗體分子過多于抗原決定簇，可導致抗體結合減少，產生陰性結果。此陰性結果并不一定缺少抗原，而是由于抗體過量。這種現象類似于凝集反應中的前帶效應(Prozone effect )。因此，必須使用一系列稀釋作“棋盤式效價滴定”檢測抗體的合適稀釋度，以得到zui大強度的特異性染色和zui弱的背景染色。抗體稀釋度應根據：①抗體效價高，溶液中特異性抗體濃度越高，工作稀釋度越高;②一般講，應用的抗體稀釋度越大，溫育時間越長。③抗體中非特異性蛋白含量、只有高稀釋度時才能防止非特異性背景染色;④稀釋用緩沖液的種類、標本的固定和處理過程等也可影響稀釋度。所以合適的稀釋度應根據自己的情況測定。抗體的稀釋主要是指*抗體，因為*抗體中特異性抗體合適的嘗試是關鍵,應用高稀釋度*抗體僅顯示主親和力的特異性染色反應,減少或消除其中交叉抗體反應。

(3)溫育時間：大部分抗體溫育時間為30-60min，必要時可4。C(約18h)。溫育的溫度常用37。C，也可在室溫中進行，對抗原抗體反應強的以室溫為佳。37。C可增強抗原抗體反應;適用于多數抗體染色，但應注意在濕盒中進行，防止切片干燥而導致失敗。

(4)多層染色法：對弱的抗原可用間接法(雙層)、PAP和ABC法(三層)、四或五層PAP法或ABC法，或PAP和ABC聯合染色法等，可以很大程度的提高敏感性，獲得良好結果。

(5)顯色增敏劑的應用，如在過氧化物酶底物中加入氯化鎳，可提高顯色敏感度4倍。

2.減少或消除非特異性染色的方法

組織中非抗原抗體反應出現的陽性染色稱為非特異性背景染色，zui常見的原因是蛋白吸附于高電荷的膠元和結締組織成分上。zui有效方法是在用*抗體前加制備第二抗體動物之非免疫血清(1：5-1：20)封閉組織上帶電荷基團而除去與*抗體非特異性結合。必要時可加入2%-5%牛血清白蛋白，可進一步減少非特異性染色。作用時間為10-20min。也可用除制備*抗體以外的其它動物血清(非免疫的)。有明顯溶血的血清不能用，以免產生非特異性染色。免疫熒光染色時，可用0.01%伊文氏蘭(PBS溶液)稀釋熒光抗體,對消除背景的非特異性熒光染色有很好的效果。當然使用特異性高、效價高的*抗體是zui重要的條件。洗滌用的緩沖液中加入0.85%~1%NaCl成為高鹽溶液,充分洗滌切片,能有效的減少非特異性結合而減少背景染色。

3.顯色反應的控制 免疫酶染色應注意控制：①成色質濃度和溫育時間可調節 ，增加成色質的量和/或增加底物溫育時間，可增加反應產物強度。著色太深可減少溫育反應時間。②過氧化物酶顯色時，H2O2較大濃度將使顯色反應過快而致背景加深;過量H2O2可能抑制酶的活性。

4.復染 根據所用的染色方法和呈顯顏色等，可選用適當的復染方法。如陽性結果呈紅或棕色，則用蘇木素將細胞核染成蘭色，以便定位檢測。也可用1%～2%甲基綠復染。

四、對照

其目的在于證明和肯定陽性結果的特異性，排除非特異性疑問。主要是針對*抗體對照，常用的對照方法包括：①陽性對照;②陰性對照;③阻斷試驗;④替代對照;⑤空白對照;⑥自身對照;⑦吸收試驗。

(一)陽性對照

用已知抗原陽性的切片與待檢標本同時進行免疫細胞化學染色，對照切片應呈陽性結果，稱為陽性對照。證明全過程均符合要求，尤其當待檢標本呈陰性結果時，陽性對照尤為重要。

(二)陰性對照

用確證不含已知抗原的標本作對照，應呈陰性結果，稱陰性對照，是陰性對照的一種。其實空白、替代、吸收和抑制試驗都屬陰性對照。當待檢標本呈陽性結果時，陰性對照就更加重要，用以排除假陽性。

五、免疫細胞化學結果的判斷

對免疫細胞化學結果的判斷應持科學的慎重態度，要準確判斷陽性和陰性，排除假陽性和假陰性結果，必須嚴格對照實驗，對新發現的陽性結果，除有對照試驗結果之外，應進行多次重復實驗，要求用幾種方法進行驗證，如用PAP法陽性，可再用ABC法驗證。必須學會判斷特異性染色和非特異性染色，對初學者更為重要，否則會得出不科學的結論。特異性染色與非特異性染色的鑒別點主要在于特異性反應產物常分布于特定的部位，如胞漿內，也有分布在細胞核和細胞表面的，即具有結構性。特異性染色表現為在同一切片上呈現不同程度的陽性染色結果。非特異性染色表現為無一定的分布規律，常為某一部位成片的均勻著色，細胞和周圍的結締組織均無區別的著色，或結締組織呈現很強的染色。非特異性染色常出現在干燥切片的邊緣，有刀痕或組織折疊的部位。在過大的組織塊，中心固定不良也會導致非特異性染色。有時可見非特異性染色和特異性染色同時存在，由于過強的非特異性染色背景不但影響對特異性染色結果的觀察和記錄，而且令人對其特異性結果產生懷疑。

(一)陽性細胞的染色特征

免疫細胞化學的呈色深淺可反映抗原存在的數量，可作為定性、定位和定量的依據。

(1)陽性細胞染色分布有三種類型：①胞漿;②細胞核;③細胞膜表面。大部分抗原見于細胞漿，可見于整個胞漿或部分胞漿。

(2)陽性細胞分布可分為煙性和彌漫性。

(3)由于細胞內含抗原量的不同，所以染色強度不一。如果細胞之間染色強度相同，常提示其反應為非特異性。

(4)陽性細胞染色定位于細胞，且與陰性細胞相互交雜分布;而非特異性染色常不限于單個細胞，而是累及一片細胞。

(5)切片邊緣、刀痕或皺折區域，壞死或擠壓的細胞區，膠原結締組織等，常表現為相同的陽性染色強度，不能用于判斷陽性。

(二)染色失敗的幾種原因

(1)所染的全部切片均為陰性結果：包括陽性對照在內，全部呈陰性反應，原因可能是：①染色未嚴格按操作步驟進行;②漏加一種抗體，或抗體失效;③緩沖液內含*，抑制了酶的活性;④底物中所加H2O2量少或失效;⑤復染或脫水劑使用不當。

(2)所有切片均呈弱陽性反應：①切片在染色過程中抗體過濃，或干燥了;②緩沖液配制中未加氯化鈉和pH值不準確，洗滌不*;③使用已變色的呈色底物溶液，或呈色反應時間過長;④抗體溫育的時間過長;⑤H2O2濃度過高，呈色速度過快;⑥粘附劑太厚。

(3)所有切片背景過深;①未用酶消化處理切片;②切片或涂片過厚;③漂洗不夠;④底物呈色反應過久;⑤蛋白質封閉不夠或所用血清溶血;⑥使用全血清抗體稀釋不夠。

(4)陽性對照染色良好，檢測的陽性標本呈陰性反應，固定和處理不當是zui常見的原因。