技術文章
山羊免疫球蛋白M(IgM)試劑盒說明書
閱讀:488 發(fā)布時間:2017-12-6山羊免疫球蛋白M(IgM)試劑盒說明書
使用目的:
本試劑盒用于測定山羊血清、血漿及相關液體樣本中羊免疫球蛋白M(IgM)含量。
實驗原理
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中山羊免疫球蛋白M(IgM)水平。用純化的山羊免
疫球蛋白M(IgM)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入免疫球蛋
白M(IgM),再與HRP標記的免疫球蛋白M(IgM)抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合
物,經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作
用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的免疫球蛋白M(IgM)呈正相關。用酶標儀在
450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中山羊免疫球蛋白M(IgM)濃度。
標本要求
1.標本采集后盡早進行提取,提取按相關文獻進行,提取后應盡快進行實驗。若不能
馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融
2.不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
山羊免疫球蛋白M(IgM)試劑盒操作步驟
1.標準品的稀釋:本試劑盒提供原倍標準品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀
釋。
12µg/ml5號標準品150µl的原倍標準品加入150µl標準品稀釋液
6µg/ml4號標準品150µl的5號標準品加入150µl標準品稀釋液
3µg/ml3號標準品150µl的4號標準品加入150µl標準品稀釋液
1.5µg/ml2號標準品150µl的3號標準品加入150µl標準品稀釋液
0.75µg/ml1號標準品150µl的2號標準品加入150µl標準品稀釋液
2.加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、標準孔、
待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50µl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40µl,
然后再加待測樣品10µl(樣品zui終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡
量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。
3.溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4.配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
5.洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此
重復5次,拍干。
6.加酶:每孔加入酶標試劑50µl,空白孔除外。
7.溫育:操作同3。
8.洗滌:操作同5。
9.顯色:每孔先加入顯色劑A50µl,再加入顯色劑B50µl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色
10分鐘.
10.終止:每孔加終止液50µl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。
11.測定:以空白空調零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應在加終止
液后15分鐘以內(nèi)進行。
操作程序總結:
計算
以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,在坐標紙上繪出標準曲線,根據(jù)樣品的
OD值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與OD值計算出標
準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),
即為樣品的實際濃度。
山羊免疫球蛋白M(IgM)試劑盒注意事項
1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未
用完,板條應裝入密封袋中保存。
2.濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。
3.各步加樣均應使用加樣器,并經(jīng)常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間
控制在5分鐘內(nèi),如標本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。
4.請每次測定的同時做標準曲線,做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本OD值
大于標準品孔*孔的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測定,計
算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。
5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6.底物請避光保存。
7.嚴格按照山羊免疫球蛋白M(IgM)試劑盒說明書的操作進行,試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9.本試劑不同批號組分不得混用。