[基因組編輯工具新工具：改造Cre重組酶]

ZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas 系統是當今十分流行的基因組編輯工具，但它們并不是*的選擇。位點特異的重組酶也很有用。如今，哈佛大學的研究人員報告了一個重組酶的突變體（Cre），其特異性比野生型的酶要高得多，這一特點對基因治療應用來說吸引力。

Nikolai Eroshenko 是哈佛大學工程和應用*的研究生。他和他的導師—的遺傳學家 George Church —在《自然-通訊》上發表了他們的研究成果。

Eroshenko 的研究方向是人類基因治療，也就是用野生型或“正確”的副本來替換突變基因。但是，將這一副本插入基因組卻并不容易。研究人員可以使用病毒，但無法控制整合位點。引入雙鏈 DNA 斷裂的核酸酶是另一種選擇，但它們需要同源重組的修復，這在人類細胞中相當罕見。

Cre 等重組酶在人類細胞中非常，也不需要內源的 DNA 修復。為了使用它們，研究人員必須改造重組酶結合位點（ loxP ）和待插入的 DNA ，剩下的就由酶來完成。一般來說，重組酶過程被認為相當特異。然而，一些證據也表明脫靶效應的可能性。

為了提高 Cre 的特異性， Eroshenko 利用數學建模來確定改善蛋白準確性而又不犧牲效率的策略。他發現，針對 Cre 形成二聚體能力（而不是與 DNA 結合）的突變有可能會成功。

隨后 Eroshenko 利用 PCR 突變法來改造蛋白 N 端附近的 α 螺旋，它參與了二聚化，而未參與 DNA 結合。利用雙選擇策略，他確定了三個突變體，它們全都保留了正確靶定 loxP 位點的能力，但又避開與 loxP 相似的假序列。他在體外以及細菌和哺乳動物細胞內將這些突變體與野生型的 Cre 重組酶進行比較，發現酶的效率稍低，但更加特異。

在大腸桿菌中，Eroshenko 觀察到野生酶的錯誤率約為 1/10,000 個細胞。“我們有些突變體要高三個數量級或以上。”

Eroshenko 表示他的長期目標是重新改造重組酶，讓它靶定 loxP 之外的位點，如人類基因組中已經存在的內源 pseudo- loxP 位點，這樣重組酶就可以用于未經修飾的基因組。

不過，梅約診所的助理教授 Karl Clark 對此結果表示很驚訝。他本人也在研究基因組編輯工具，包括重組酶 Cre。“我沒有聽到很多人抱怨 Cre/loxP 是非選擇性的，”他說。

Clark 表示，他計劃在其實驗室中嘗試這些新的突變體，看看它們是否在斑馬魚中起作用。他指出，對于許多應用，如轉基因應用，利用 Cre 來短暫激活沉默的基因，野生酶的準確性已足夠。 {試劑酶聯網：www.shjgogo.com}   ELISA試劑盒相關產品推薦：

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