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蔗糖磷酸化酶(SPase)試劑盒,微板法

蔗糖磷酸化酶(SPase)試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 蔗糖磷酸化酶（Sucrose Phosphorylase, SP）試劑盒說明書 （貨號：WS4150W 微板法 96 樣） 一、產(chǎn)品簡介： 蔗糖磷酸化酶(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中，是一種葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，催化葡萄糖基轉(zhuǎn)移到 果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等，合成相應(yīng)的葡萄糖基低聚糖。在食品，化妝品，醫(yī)藥行業(yè)具有廣泛的應(yīng) 用。 本試劑盒提供一種簡單，靈敏，快速的測定方法：蔗糖磷酸化酶以磷酸為受體，催化蔗糖產(chǎn)生 1-磷酸 葡萄糖，在相應(yīng)酶混合物的作用下使 NADP+還原成 NADPH，進(jìn)而與特異的顯色劑反應(yīng)，產(chǎn)生在 450nm 有 吸收峰的黃色物質(zhì)，可算出蔗糖磷酸化酶（SP）的活性大小。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 110mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 液體 15mL×1 瓶 4℃保存 試劑二 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 臨用前加 1.1mL 蒸餾水溶解，仍-20℃保存 試劑三 液體 14μL×1 支 -20℃保存 臨用前加 1.1mL 蒸餾水溶解，仍-20℃保存 試劑四 液體 1.1mL×1 支 4℃保存 試劑五 粉劑 mg×1 瓶 4℃保存 臨用前加 5.3mL 蒸餾水溶解，仍 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑 mg×1 支 -20℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、可調(diào)式移液器、天平、低溫離心機(jī)、研缽、冰、蒸餾水。 四、蔗糖磷酸化酶（SP）活性測定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本制備： ① 組織樣本： 稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰浴勻漿，12000rpm，4℃離心 10min，取 上清液置于冰上待測。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取 ② 細(xì)菌/真菌樣本： 取約 500 萬個(gè)細(xì)胞，加入 1mL 提取液，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3S， 間隔 5S，總時(shí)間 3min）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清液置于冰上待測 【注】：若增加樣本量，按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取 2、 上機(jī)檢測： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長至 450nm。 ② 所有試劑在檢測前解凍至常溫（25℃）狀態(tài)。 ③ 在 96 孔板中依次加入： 試劑名稱（μL） 測定管 樣本 10 試劑一 110 試劑二 10 試劑三 10 試劑四 10 試劑五 50 室溫（25℃）下反應(yīng)，混勻后，立即于 450nm 處讀取吸光值本試劑盒僅供科研使用 2 A1，40S 后讀取 A2?！?/span>A=A2-A1。 【注】：1 若△A 值在零附近，可以適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間，每隔 20s 讀取一次吸光值，選擇吸 光值呈線性增長的一段反應(yīng)時(shí)間 T，重新確定的 T 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 2 若樣本做特殊處理或本身含有高濃度的還原型物質(zhì)（如維生素 * 等，），需加設(shè)一 個(gè)樣本自身對照（對照加樣順序：10μL 樣本+160μL 試劑一+10μL 試劑二+10μL 試劑三+10μL 試劑四） 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 0.0862x - 0.0108，x 是 NADPH 摩爾質(zhì)量：nmol,y 是ΔA。 2、按照蛋白濃度計(jì)算 單位定義：在 25℃條件下，每毫克蛋白質(zhì)每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 為一個(gè)酶活單位。 SP 活性（nmol/min /mg prot）=[(ΔA+0.0108)÷0.0862] ÷(Cpr×V1)÷T=1740×(ΔA+0.0108)÷Cpr 3、按照樣本質(zhì)量計(jì)算 單位定義：在 25℃條件下，每克樣本每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 為一個(gè)酶活單位。 SP 活性（nmol/min /g 鮮重）=[(ΔA+0.0108)÷0.0862] ÷(W×V1÷V)÷T=1740×(ΔA+0.0108)÷W 4、 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算 單位定義：在 25℃條件下，每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol NADPH 為一個(gè)酶活單位。 SP 活性（nmol/min/104 cell）=[(ΔA+0.0108)÷0.0862]÷(500×V1÷V)÷T=3.48×(ΔA+0.0108) V----加入提取液體積，1 mL； V1----反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL； W----樣本質(zhì)量，g； T----反應(yīng)時(shí)間，40s=2/3 min； Cpr----蛋白濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測試劑盒。 注意事項(xiàng)： 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1nmol/μL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸餾水（母液需在兩 天內(nèi)用且-20℃保存）。 2 把母液稀釋成六個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. nmol/μL。也可根據(jù)實(shí)際 樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 依據(jù)加樣表操作，根據(jù)結(jié)果即可制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。