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PCR檢測試劑盒PCR擴增DNA片段只是一個重要手段。擴增片段的檢測和分析才是目的,根據研究對象和目的的不同而采用不同的分析法。瓊脂糖凝膠電泳可幫助判斷擴增產物的大小,有助于擴增產物的鑒定,點雜交除可鑒定擴增產物外,還有助于產物的分型;Southern雜交分析可從非特異擴增產物中鑒定出特異產物的大小,增加檢測的特異性與敏感性,最近發展的一系列產物分析法(PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等)均有助于產物的精確分析。PCR檢測試劑盒擴增產物分析方法剖析如下:
一、凝膠電泳分析法
PCR產物可通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,以前者常用,通過電泳可以判斷擴增產物的大小。在臨床檢測中,僅通過凝膠電泳判斷擴增片段大小即可滿足檢測的需要。通常制膠方法為100mlTBE加1.5g瓊脂糖在微波鍋內溶解,稍冷后倒入電泳槽。
電泳后,用溴化乙淀染色20min,然后用去離子水漂洗2次,每次15min,于UV燈下觀察結果并拍照。
凝膠電泳不僅可以鑒定產物的大小,檢測擴增的情況,還可以用來純化擴增產物。
二、點雜交
當擴增產物是多條帶時,用點雜交更合適。這種方法的基本過程是,首先將擴增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上,再用放射性或非放射性標記物標記的探針雜交。點雜交還有助于檢測突變DNA的突變類型,用于人類遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同位素32P標記的寡核苷酸探針檢測的敏感性、特異性和方法的可靠性均不容懷疑,對人們認識某些疾病與基因變異的關系起了很大的作用。但是,由于同位素不穩定和放射性危害,不能常規用于臨床或法醫檢驗,用非放射性物質標記的寡核苷酸探針分析PCR產物以確定核酸序列變異則是一種簡便而安全的方法。非放射性標記物質穩定性高,使用方便、安全、檢測速度快。
三、微孔板夾心雜交法
該法是通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產物的某一區域特異雜交使產物間接地固定于微孔板上。然后,再用一生物su 等非放射性標記物標記的檢測探針與產物的另一區域雜交,漂洗后顯色即可判斷結果,該法需要兩個雜交過程來檢測一個產物,因此,其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用于HBV的檢測,其敏感度可達5個HBv DNA分子。此法的敏感性和特異性與PCR 32P探針的Southern雜交法相當。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡便、快速、避免了同位素標記探針的危害,顯色反應類似于臨床常規應用的ELISA,適于臨床實驗室常規應用。
四、PCR-ELISA法
本法避免了電泳和雜交的步驟,適于常規ELISA記數儀檢測。因為5'端修飾后仍可進行常規PCR擴增特異靶序列。因此,可以通過修飾一個引物的5′端使其攜帶便于PCR產物固定的功能基因,而通過另一引物5′-端的修飾使產物便于檢測。
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