液相色譜（HPLC）法是以高壓下的液體為流動相，并采用顆粒極細的固定相的柱色譜分離技術。液相色譜對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發性和熱穩定性的限制，因而彌補了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用液相色譜來分析。 

液相色譜的五大進樣系統：

1、進樣系統
進樣系統分為手動進樣閥和自動進樣器。

手動進樣閥
對于手動進樣閥使用過程中需要注意每個樣品進樣完成后應對進樣閥進行清洗，防止殘留對下一個樣品分析的影響。還需要注意進樣方式，以20μL定量環為例，我們可以選擇*充滿定量管或部分充滿定量管。為了保證進樣的重復性，選擇*充滿定量管進樣方式時，需要注入定量環體積3倍以上的樣品;選擇部分充滿定量管進樣方式時，進樣體積應在定量管體積一半以下，即1-10μL。

自動進樣器
如果采用自動進樣器進樣，首先需要保證注射器里面沒有氣泡存在，否則影響進樣量準確性；其次是樣品瓶里面有足夠的樣品，保證進樣針能夠吸到樣品。為了避免交叉污染需要定期對樣品瓶、蓋和墊進行清洗。若自動進樣器長時間不使用，應該注意：腐蝕性的流動相或洗液(例如，堿性或酸性緩沖溶液)必須*從系統中置換出來。同時，為了避免細菌的生長，應將一個樣品瓶中充滿甲醇，并重復幾次進樣操作。

2、輸液系統
*按輸出液恒定的因素分恒壓泵和恒流泵。對液相色譜分析來說，*的流量穩定性更為重要，這是因為流速的變化會引起溶質的保留值的變化，而保留值是色譜定性的主要依據之一。因此，恒流泵的應用更廣泛。

*按工作方式分為氣動泵和機械泵兩大類。機械泵中又有螺旋傳動*、單活塞往復泵、雙活塞往復泵和往復式隔膜泵。

HPLC使用的高壓泵應滿足下列條件：
a 流量恒定，無脈動，并有較大的調節范圍（一般為1～10ml/min）；
b 能抗溶劑腐蝕；
c 有較高的輸液壓力；對一般分離，60×105Pa的壓力就滿足了，對分離，要求達到150～300×105Pa。

（1）往復式柱塞泵結構和原理
當柱塞推入缸體時，泵頭出口（上部）的單向閥打開，同時，流動相進入的單向閥（下部）關閉，這時就輸出少量的流體。反之，當柱塞向外拉時，流動相入口的單向閥打開，出口的單向閥同時關閉，一定量的流動相就由其儲液器吸入缸體中。這種泵的特點是不受整個色譜體系中其余部分阻力稍有變化的影響，連續供給恒定體積的流動相。

（2）氣動放大泵結構和原理
其工作原理是：壓力為p1的低壓氣體推動大面積（SA ）活塞A，則在小面積（SB ）活塞B輸出壓力增大至p2的液體。壓力增大的倍數取決于A和B兩活塞的面積比，如果A與B的面積之比為50：1 ，則壓力為5×105Pa的氣體就可得到壓力為250×105Pa的輸出液體。這是一種恒壓泵。

泵頭通常由兩部分組成--單向閥和密封圈-柱塞桿。單向閥一般由閥體\塑料\或陶瓷閥座和紅寶石球組成，在壓力的作用下寶石球離開閥座，流動相流過單向閥；反之，在反向力的作用下，寶石球回到閥座上，此時流動相不再流過單向閥，顯然寶石球與閥座之間的配合必須非常適合才能防止流動相的泄漏。為了保證單向閥不發生泄漏，一些單向閥中安裝了兩套寶石球和閥座，也有一些單向閥是將寶石球用一個合適的彈簧壓在閥座上。在不同的應用領域，單向閥閥體的材料有所不同，例如考慮生物兼容性的系統，單向閥的閥體往往采用金屬鈦，而不用不銹鋼。為了降低成本和減少維護費用，一些生產廠商還采用了可置換式的卡套式塑料單元件，當然其功能仍保持不變。

輸液系統即是指高壓恒流泵，其作用是能提供穩定準確的流速。

溶劑過濾頭：吸液過濾頭，或稱沉子，主要作用是過濾流動相中可能存在的顆粒性雜質。長時間使用后，雜質有可能阻塞溶劑過濾頭上的過濾板孔隙;或長時間使用緩沖液，過濾頭表面容易產生一層膜，阻礙流動相正常通過。嚴重時，即使是已超聲過的溶劑，泵吸液時也會有氣泡在四氟輸液管里產生，因此應經常對過濾頭進行清洗。清洗溶劑可以選擇乙醇或者30%稀硝酸溶液，正相系統需注意濾頭的烘干處理。

單向閥：單向閥的作用是確保液體向一個方向流動，是高壓恒流泵穩定輸液的保證。日常使用過程中，可以通過觀察壓力的情況，初步判斷流量是否正常。如果系統已經平衡一段時間，壓力應該是穩定的。但如果壓力存在波動，則表明流量不穩定;如果無壓力，則表明無流量。這兩種情況大多是因為單向閥里混入了氣泡或雜質。混入氣泡的情況，應把放空閥打開，按沖洗鍵將里面的氣泡排出。單向閥混入雜質的情況，須對其進行清洗。清洗溶劑可以選擇乙醇，安裝時注意標記環的方向。

密封圈：密封圈是固定在柱塞桿上防止泵腔內的液體泄漏，是保證泵頭輸液正常的關鍵部件。但柱塞桿和柱塞密封圈長期使用會發生磨損，主要與流量、操作壓力和所使用的流動相有關。當使用含鹽的流動相時，由于脫水或蒸發，可能形成鹽結晶，而泵運動時鹽結晶會導致密封圈和柱塞桿的磨損。因此，每天實驗前和實驗后都需用純水沖洗一次密封圈(在柱塞密封圈和二級密封圈之間)，保持清洗管內有水以防止形成晶體，延長柱塞桿和密封圈的使用壽命。

在線過濾器：為了防止由于流動相雜質微粒進入色譜系統，泵在放空閥內安裝了在線過濾器，經泵出口流出的液體通過在線過濾器，經排空管流出的液體不通過在線過濾器。儀器使用一定時間后，建議用戶清洗在線過濾器的燒結不銹鋼過濾片。用扳手卸下壓帽，將密封環和燒結不銹鋼過濾片一同取出清洗，清洗后按原位裝上。清洗溶劑可以選擇30%稀硝酸溶液，正相系統需注意濾頭的烘干處理。

3、分離系統
分離系統包括色譜柱、保護柱以及柱溫箱。

色譜柱：色譜柱是樣品分離的核心。色譜柱在使用前必須仔細閱讀說明書，了解色譜柱使用的pH值范圍、溶劑耐受范圍、壓力范圍和維護方法等事項。色譜柱使用完后，需及時對色譜柱進行沖洗。沖洗完成后，應該將色譜柱從儀器上拆下來，兩端用廠家配的堵頭密封后，保存在色譜柱盒里。

保護柱：保護柱的作用主要是防止吸附性強的雜質對色譜柱污染，從而延長色譜柱的壽命。針對不同型號的色譜柱，應選擇相對應填料的保護柱。應注意柱芯也是有壽命的，應該定期進行更換。

柱溫箱：色譜柱溫度變化，可能會導致保留時間的變化。為了避免這個問題，建議使用柱溫箱。

4、檢測系統
液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。

（1）紫外檢測器
該檢測器適用于對紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測。其特點是，使用面廣（如蛋白質、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）、靈敏度高（檢測下限為10-10g/ml）、線性范圍寬、對溫度和流速變化不敏感、可檢測梯度溶液洗脫的樣品。

（2）示差折光檢測器
凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。目前，糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作簡單，但靈敏度低（檢測下限為10-7g/ml），流動相的變化會引起折光率的變化，因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測。

（3）熒光檢測器
凡具有熒光的物質，在一定條件下，其發射光的熒光強度與物質的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用于具有熒光的有機化合物（如多環芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等）的測定，其靈敏度很高（檢測下限為10-12～10-14g/ml），痕量分析和梯度洗脫樣品的檢測均可采用。

HPLC常用的檢測器是紫外檢測器。在日常使用過程中紫外檢測器主要需要注意檢測池和氘燈的使用與維護。

檢測池：檢測池長時間使用可能會造成污染，如果儀器的參比能量(REF ENERGY)正常，測量能量(SMPENERGY)偏低，可能為檢測池污染導致，可以對檢測池進行清洗。對檢測池零件的進行清洗，一般先采用約1：4的硝酸溶液超聲清洗，分別用純水和甲醇溶液清洗，然后重新組裝并將檢測池池體推進池腔內，擰緊池板螺絲。注意組裝中，池玻璃及墊片一定要放正，以免壓碎池玻璃，造成檢測池泄漏。

氘燈：氘燈正常使用壽命可在1500小時以上。燈的使用壽命與檢測器的使用時間和開啟頻率有關，因此使用過程中應盡量節省不必要的開機時間，減少開關頻率，以延長氘燈的使用壽命。如果準確地判斷出氘燈已經不能點亮或能量太低，則需要更換新的氘燈。在購買氘燈時，應注意咨詢和核對氘燈的型號與儀器型號是否匹配。更換到氘燈時，參照儀器說明書中的相關內容，特別要注意氘燈連接線的位置順序。

5、數據處理系統
該系統可對測試數據進行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。

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